聚合酶链式反应（PCR）反应条件

1. 预变性：

95℃，5～10min；
进行PCR反应的第yi 步是要对反应体系进行预变性，该过程的目的是使模板DNA分子*变性同时激活热稳定的DNA聚合酶，具体时间建议参考所用DNA聚合酶的使用说明书。

2. 按如下过程，进行30次循环“变性-退火-延伸”的PCR反应：

2.1 变性：

95℃，10～30s；

正常的PCR循环过程中，变性的时间不需要太长，30s以内即可完成目的DNA片段的变性，在可能的情况下可缩短该过程的时间，因为变性的时间过长会损害DNA聚合酶的活性。

2.2 引物退火：

引物特定退火温度，30s；

退火的温度由引物和产物的Tm值决定，如果退火温度选择不合适，会导致非特异性的扩增。

*适合的退火温度T = 0.3 × Tm(引物) + 0.7 × Tm(产物) - 25；

Tm(产物) = 8.15 + 16.6lg[k+] + 0.41 × GC% - 675/L，L为PCR产物的长度。

2.3 引物延伸：

72℃，1min。

引物与模板结合后的延伸过程一般在72℃进行，该温度下DNA聚合酶的活性* 高，该过程的时间由目的扩增片段的长度决定，一般时间为1min/kb，即目的片段的长度为1000bp时，延伸时间设为1min。

3. PCR反应的最后延伸和终止

在*后一次反应循环结束后，应使PCR反应在72℃进一步延伸5～10min，使得未*延伸的扩增片段全部延伸*，以提高产物的扩增效率；

然后，将反应混合物冷却到4℃，或加入10mmol/L的EDTA终止反应。