细胞系注意事项与技术要点

细胞系注意事项：

l、4ml肝素抗凝血于离心管中，加入2mlRPMI1640。

2、混匀后沿管壁缓慢加到预置有4ml淋巴细胞分离液的液面上静置30min。

3、1500rpm，15min，吸取白细胞层(第二层)于另一离心管中。

4、加RPMI16405ml洗涤白细胞两次。

5、将白细胞接种至1mlRPMI1640培养基中，加入10μl环胞霉素和100μl的EBV(EB病毒)液，混匀。

6、水浴摇床，40次/分，37℃，3hr。

7、1500rpm，15min。将细胞接种至1ml培养基中(内含*1mM/ml)加入10μl环胞霉素，轻轻混匀，37℃培养。

8、5天后观察细胞转化和生长情况，决定是否半量换液。一般半量换液l-2次，并维持环胞霉素的浓度。

9、待转化细胞数量明显上升，并出现细胞团块后，可转入25ml细胞培养瓶中，加1-2ml培养基，37℃培养10-15天，一般每隔3-4天观察一次，决定是否换液，传代。

10、细胞生长达一定数量后冻存，冻存前应进行核型分析和存档。

细胞系技术要点：

1、取材：材料主要来源于*或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。取材后尽快培养，因故不能立即培养者，可冻存。其培养方法及冻存方法同前述正常组织。

2、成纤维细胞排除：在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞，培养时能与瘤细胞同时生长，并常压过癌细胞，导致癌细胞生长受阻以至消失，应仔细排除。排除方法常有：机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法等。

3、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率
根据实验经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。一般当肿瘤组成或细胞被原代培养后，要经过对新环境的适应才能生长，因此不能局限于一般培养法，须采用一些特殊措施。如：用适宜底物，鼠尾胶原底层及饲细胞底层等。用细胞生长因子，根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子，如胰岛素、雌激素等。也可以考虑动物媒介培养。